鹿明生物提供LCMSMS蛋白组学技术研

●前言

东南大学医学院院长刘必成教授领导的肾脏病研究所在Scienceadvances期刊发表了题为的研究成果，通过蛋白组学+多层组学研究方法，建立IL-10细胞囊泡高表达模型的构建，提出并验证了IL-10细胞外囊泡的靶向缺血性肾损伤的假说，探究了IL-10细胞外囊泡作为新型纳米药物的机理。

中文标题：细胞外囊泡包裹的IL-10作为抗缺血性急性肾损伤的新型纳米疗法

研究方向：新药研发及其机制研究

发表期刊：Scienceadvances

影响因子：14.

发表单位：中国南京医院肾内科

运用生物技术：LC-MS/MS蛋白组学（由鹿明生物提供技术支持）、WB免疫印迹技术、ELISA酶联免疫吸附技术、免疫组化+荧光显色、流式细胞术分析、RT-PCR

●研究背景

急性肾损伤（AKI）是指各种原因引起的短时间内(数小时至数天)肾功能快速减退而出现的临床综合征是一种具有高住院率和高死亡率的疾病，但是，对于已确定的AKI，目前没有明确的疗法来治疗或防止其进展为慢性肾病（CKD）。

白细胞介素-10(IL-10)是一种强大的免疫调节剂，具有很强的抗炎和组织再生能力。研究表明IL-10可以通过限制炎性细胞因子的产生和免疫细胞的浸润来预防缺血或输尿管梗阻引起的肾损伤。然而，由于其化学和物理的不稳定性，在疾病治疗过程中IL-10会不可避免地激活循环中的白细胞，导致治疗效果降低甚至引起并发症。所以，解决问题的关键是提高IL-10的稳定性。

●研究思路

图

前期药物制备流程

图

药物应用及验证流程

●研究结果

1.IL-10细胞囊泡的制备及Westernblot、ELISA验证

将编码小鼠IL-10的质粒转染RAW.7巨噬细胞，并用地塞米松刺激巨噬细胞M2c表型，得到过表达的IL-10细胞囊泡。为了验证该方法的可行性和有效性，首先将红色荧光蛋白(RFP)标记的IL-10转染到RAW细胞中，观察IL-10在细胞内的分布。如图1A所示，在细胞质或膜区附近观察到大量的点状IL-10信号，提示IL-10可能被包裹在某些亚细胞结构中。为了进一步确认IL-10阳性EV的存在，利用免疫组化技术，用CD63作为多囊泡体和外泌体的标记物进行免疫染色，IL-10和CD63在细胞内和细胞外均表现出共定位(图1B)，表明IL-10在多泡体中富集，并可通过EV释放；研究人员用Westernblot蛋白免疫印迹技术和ELISA酶联免疫印迹技术验证了该方法制备细胞囊泡可将IL-10表达水平提高7倍。这些数据表明，制备IL-10+EV的策略是可行和有效的。

图1

IL-10+ev的制备和表征

(A)用rfp标记的IL-10转染RAW细胞，然后用地塞米松刺激。RFP免疫染色检测IL-10在细胞内的分布。右边的方框是该方框区域的热图可视化。比例尺:10μm;

(B)IL-10(绿色)和EV标记物CD63(红色)在RAW细胞中的免疫染色。黄色方框是合并图像中方框区域的放大倍数。比例尺:10μm。

(C)IL-10+ev中ev相关标志物(Alix,CD63和CD81)和巨噬细胞相关标志物(CD68和CD)的Westernblotting分析。

(D)IL-10+ev的大小分布及代表性TEM图像。

(E)从抗体阵列分析中获得的每个细胞因子的蛋白质水平(归一化为阵列参考)热图。M0ev，来自未处理RAW细胞的ev。G-CSF，粒细胞集落刺激因子;GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;干扰素-γ干扰素-γ;M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子;TNF-α，肿瘤坏死因子α。

(F)的ELISA分析il-10在电动汽车,和免疫印迹分析il-10、il-10受体在il-10+电动汽车(n=3或6)。

(G)il-10mRNA在il-10+电动汽车是衡量实时定量聚合酶链反应(n=3)。

(H和I)的比较稳定的il-10+EVs和免费的il-10在不同条件下,包括37岁或80C一周,在ph5.5溶液中悬浮12小时。然后采用ELISA法检测不同时间点的IL-10浓度(n=3)，数据以平均值SD表示。**Plt;0.01和***P0.，双尾t检验(F、G、I)和单因素方差分析(ANOVA)(H)。IP-10，干扰素γ诱导蛋白10;I-TAC，干扰素诱导的t细胞α趋化剂;KC,C-X-C基序趋化因子1;单核细胞趋化蛋白-1;单核细胞趋化蛋白-5;MIG，干扰素-γ诱导的单因子;MIP-1a巨噬细胞炎症蛋白1α;RANTES，调节激活，t细胞表达和分泌;SDF-1，基质细胞衍生因子1;TARC、胸腺和活化调节趋化因子;金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1;TREM-1，单核细胞1上的触发受体。

2.IL-10+EVs肾脏靶向研究

有研究表明，EVs具有用多种配体和受体修饰的脂质双层膜，这些配体和受体可以与靶细胞相互作用，使它们成为靶向递送候选物。因此，本研究采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)来评估IL-10细胞囊泡的蛋白质组成，共鉴定出种差异蛋白质，其中种与质膜相关，且IL-10整合素表达谱比对照组丰富(图2A)，表明整合素在EVs中富集。为了验证整合素α的存在，利用Westernblot蛋白质印迹进行了验证(图2B)。有研究已确定，外体整合素可与血管细胞粘附分子、纤连蛋白和细胞间粘附分子相互作用，介导炎症部位的外体摄取。因此，研究人员提出IL-10细胞囊泡在整合素的帮助下，可以靶向损伤的肾脏。

为了验证IL-10细胞囊泡在体内的肾脏靶向，首先用DID标记EVs，健康小鼠中静脉注射EVs时，DID荧光主要分布在肝脏，仅少量分布在肾脏(图2C)。相比之下，肾DID荧光在缺血/再灌注损伤(IRI)组显著增加，并在注射后12小时达到峰值，而其他器官无明显变化(图2C)。随着缺血时间的延长，IL-10的积累在缺血/再灌注肾脏的内皮祖细胞逐渐增多(图2D)，提示IL-10+随着损伤的加重，EVs可越来越多地靶向进入肾脏。

随后，在体外探索了pkh67标记的IL-10+EV的靶向能力。与对照细胞相比，缺氧/复氧(H/R)刺激的TECs摄取IL-10+EV的效率提高了3倍(图2F)。流式细胞术分析显示，PKH67标记的EV主要被CD54+(ICAM-1+)细胞所吸收(图2G)，提示IL-10+EV可通过细胞表面ITGαLβ2靶向损伤细胞上的ICAM-1。这些结果表明，IL-10+EV在体内和体外均对受损肾脏具有优先靶向作用。

图2

IL-10+ev的肾靶向

(A)以亲本RAW细胞为对照，IL-10+ev的蛋白质组成的LC-MS/MS分析。整合素在IL-10+ev和亲代细胞中表达。

(B)IL-10+ev上ITGα4、ITGα5、ITGαL、ITGαM、ITGβ1和ITGβ2的Westernblotting分析。(C至E)在体内分布方面，小鼠静脉注射did标记的IL-10+ev(n=3)。

(C)注射后6、12、24、48和96小时(缺血时间35分钟)指示器官的荧光强度成像。

(D)缺血时间为20、28、35分钟的IRI肾脏12小时的荧光强度成像。

(E)具有代表性的共聚焦图像显示，在冰冻肾切片中，在包括近端小管[水通道蛋白1(AQP1)]和远端小管[NaCl共转运蛋白(NCC)]、内皮细胞(CD31)和巨噬细胞(CD68)在内的小管中积累了具有dii标记的IL-10+ev。DT,远端小管;PT,近端小管。比例尺为10μm。

(F和G)H/r诱导的TECs中pkh67标记的IL-10+ev的细胞摄取(n=3)。(F)培养12小时后每个细胞中pkh67标记的IL-10+ev的代表性共聚焦图像和定量。TNF免疫染色显示细胞炎症。比例尺:10μm。(G)CD54+PKH67+细胞的流式细胞术分析。PE、藻红蛋白。数据以平均值±SD表示。#Plt;0.05,**Plt;0.01***Plt;0.，双尾t检验(C、E、F)和单因素方差分析(D、G)。

3.IL-10+EV对小鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）具有保护作用

为了评价IL-10的治疗效果，建立了小鼠肾缺血再灌注损伤模型，再灌注后静脉注射EVs，每24小时一次，持续3天(图3A)。在IRI组中，双侧肾损伤导致血清肌酐水平显著升高、tec坏死和脱落、细胞碎片积聚和管型形成，IL-10+EV对这些损伤参数的改善呈剂量依赖性(图3,B至D)。

为了充分评估IL-10+EV的疗效，肾切片采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记(TUNEL)检测凋亡指数，并用抗肾损伤分子-1(KIM-1)抗体染色检测受损小管。结果表明，IL-10+EV处理的小鼠凋亡细胞减少(图3，E和G)，并且KIM-1在IL-10+EV处理组中水平较低(图3，F和H)，并伴有裂解的半胱天冬酶-3的表达降低(图3I)。此外，肿瘤坏死因子、IL-6、IL-1β、C-C基序趋化因子配体2(CCL-2)和CCL-5也被IL-10+EV以剂量依赖的方式下调(图3J)。提示IL-10+EVs可减轻小鼠缺血性AKI。

图3

IL-10+EVs对小鼠肾脏缺血再灌注损伤有保护作用。

(A)实验设计示意图。简而言之，小鼠同时接受IL-10治疗+肾I/R损伤后每24小时注射一次EVs(和μg)或赋形剂，并在疾病诱导后3天实施安乐死。

(B)白细胞介素-10的影响+EVs对血清肌酐的影响(n=10).

(C)基于HE染色的肾小管损伤量化(n=10).

(D)肾皮质和髓质的HE染色的代表性图像。比例尺，μm

(E和G)凋亡细胞的TUNEL染色和定量的代表性图像(n=6).比例尺，50μmHFP，高功率场；（F和H)金-1的代表性共焦图像和量化+小管(n=6).比例尺，20μm(我)肾组织中caspase-3的蛋白质印迹分析(n=3).HPF，高功率场。（J)肾组织中炎性细胞因子mRNA水平的实时定量PCR分析(n=6).数据以标准差的方式表示。*P%3C0.05，**P%3C0.01，和***P%3C0.对IRI组，#P%3C0.05，#P%3C0.01，和###P%3C0.，单向方差分析

4.IL-10+EVs治疗肾小管损伤的机制研究__抑制mTOR信号传导并诱导有丝分裂

mTOR复合物1（mTORC1）是自噬的主要负调节因子，已有研究观察到IL-10通过抑制mTORC1在控制巨噬细胞代谢中的关键作用，然而，尚不清楚IL-10+EVs是如何作用于上皮细胞。研究人员利用Westernblot蛋白免疫印迹检查了肾组织中的mTOR信号，发现IL-10+EVs抑制了mTORC1的激活，其下游靶点(包括S6K、S6和4E-BP1)的磷酸化降低表明了这一点(图4A)。肾皮质透射电镜分析证实IL-10+EVs在tec中诱导更高水平的自噬体和自溶体(图4B)。此外，IL-10+EVs在体外培养的tec中也抑制mTOR信号传导并诱导有丝分裂。自噬体在与溶酶体融合后成熟为自溶体。为此，研究人员对线粒体和溶酶体进行了共定位，发现IL-10+EVs后线粒体与溶酶体的共定位显著增加治疗。

有丝分裂的肾脏保护功能主要是通过清除受损的线粒体来维持细胞器的质量和功能。如所示图4(C至E)，白介素-10+EVs暴露导致H/R刺激后线粒体功能障碍显著减少，从氧消耗率(OCR)、线粒体膜电位水平的增加和线粒体活性氧(ROS)产生(mitoSOX)的减少可以证明。此外，我们还检查了体内肾线粒体功能的状态，发现IL-10+EVs治疗后IRI组的肿瘤坏死因子-α明显改善。当IL-10信号被IL-10受体阻断抗体抑制时，IL-10+EVs未能恢复线粒体功能(图4，C至H)并且不再提供肾保护(图S6)。总的来说，这些数据证明IL-10+EVs在体内外都能促进tec的有丝分裂。白介素-10+EVs通过诱导有丝分裂来维持线粒体适应性，从而保护肾小管免受损伤。

图4

IL-10+EVs抑制mTOR信号并诱导线粒体自噬以维持线粒体适应

(A)肾组织中mTOR信号和LC3的Westernblotting分析(n=3)。

(B)肾小管自噬事件的代表性TEM图像。定量每个细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量(n=3)。红色箭头表示自噬;绿色箭头,mitophagy。比例尺，2μm。

(C至E)IL-10+EVs对培养的TECs线粒体功能影响的评估(n=3)。(C)采用Seahorse法检测TECsOCR的实时变化。OCR，耗氧量;BR,基底呼吸;MRC，最大呼吸能力;n,不重要。(D)流式细胞术分析用MitoSOX标记的TECs中线粒体ROS的产生。(E)流式细胞术分析用JC-1标记的TECs线粒体膜电位。

(F)肾小管线粒体代表性TEM图像。比例尺为1μm。

(G)免疫组织化学分析肾切片细胞色素c氧化酶亚基I(MT-CO1)的表达。比例尺，μm。

(H)线粒体呼吸链复合物I酶活性(n=6)。数据以平均值±SD表示。*Plt;0.05,**Plt;0.01，和***P0.比IRI组或HR组，单因素方差分析

5.IL-10+EVs诱导肾巨噬细胞转移

巨噬细胞通常是IL-10的主要靶细胞，具有促进M2巨噬细胞极化的潜力，从而有助于组织修复。假设IL-10+EVs可以通过调节巨噬细胞表型来解决肾脏缺血再灌注损伤。如所示图5(甲和乙)，骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中CD的表达具有IL-10+EVs剂量依赖性，但未能诱导CD86，表明来自EVs的IL-10在M2巨噬细胞诱导中起关键作用。与这个想法一致的是，IL-10+EVs治疗的小鼠表现出肾巨噬细胞群向CD的转移(图5，C和D)。对肾巨噬细胞的实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析也显示IL-10+EVs治疗后M2表型显著增加(图5E)。这些结果表明白IL-10+EVs高效驱动M2巨噬细胞极化，可抑制炎症，促进肾脏修复。

图5

IL-10+ev诱导肾巨噬细胞转移。

(A和B)分别用LPS(ng/ml)、IL-4(20ng/ml)+IL-13(20ng/ml)或不同剂量的IL-10+EVs(5、15、30μg)刺激BMDMs48小时(n=3)。(A)流式细胞术分析CD86和CD的表达。(B)IL-10+ev对CD表达的剂量依赖效应。(C至E)IRI组与IL-10+EV组肾巨噬细胞表型变化的探讨。

(C)肾脏中F4/80+CD86+或F4/80+CD+巨噬细胞的流式细胞术分析(n=3)。

(D)肾脏切片中CD68+CD86+或CD68+CD+巨噬细胞的代表性共聚焦图像(n=5)。巨噬细胞的转移以CD+/CD86+表现。

(E)实时定量PCR检测从肾脏分离的巨噬细胞中m1样(TNF和iNOS)和m2样(CD和Arg-1)标记物(n=3)。数据以平均值±SD表示。*P0.05和***P0.对IRI组，单因素方差分析(B)，双尾t检验(C至E)。

6.IL-10+EVs减弱急性肾损伤到慢性肾病的转变

为了验证AKI后能否长期存活，采用35min的单侧IRI方法。正如预期的那样，单侧IRI后4周肾切片的组织学分析显示显著的肾小管间质损伤，包括肾小管萎缩、tec变平和脱落、管型形成、白细胞斑片状浸润和纤维化，所有这些都被IL-10+EVs显著改善治疗(图6，A和B)。利用WB免疫印迹技术和免疫荧光染色技术对慢性肾脏病的特征指标进行检测，结果显示IL-10+EVs治疗的肾组织中ⅰ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白沉积与对照组相比明显减少(图6C)，巨噬细胞和T细胞的钝化浸润(图6D)。这些数据表明IL-10+EVs可以中断AKI到CKD的进展。

综合以上实验结果和先前的报告，研究人员推测帮助肾小管修复和恢复线粒体功能是IL-10+EVs治疗的关键机制。

7.对IL-10+EVs处理过的老鼠进行的毒性和炎症评估

心脏、肝脏、脾脏和肺进行组织学分析评估得到结论，IL-10+EVs没有体内毒性。

图6

IL-10+ev减弱AKI-CKD转变。采用单侧35minIRI，再灌注后静脉注射IL-10+ev(μg)，每24小时持续一次，共3次。在发病4周后对小鼠实施安乐死。

(A)PAS染色的代表性图像(n=6)。底部为框化区域的放大倍数。比例尺，μm(上)和μm(下)。

(B)矢状切片Masson三色染色代表性图像(n=6)。底部为框状区域的放大倍数。比例尺，1毫米(顶部)和μm(底部)。(C)肾组织中I型胶原(Col.I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的Westernblot分析(n=4)。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

(D)肾脏切片CD68+CD86+或CD68+CD+巨噬细胞共聚焦图像(n=6)，比例尺10μm。(E)IL-10+ev制备治疗缺血性AKI示意图。数据以平均值±SD表示；

●研究结论

研究表明，IL-10细胞囊泡靶向治疗具有独特的优势：

(1)改善了IL-10的药代动力学特性，使其更加稳定、安全和可靶向损伤部位;

(2)将IL-10的治疗靶点扩展到免疫细胞和肾小管细胞。

从机理上讲，IL-10+EVs抑制mTOR信号传导，从而促进有丝分裂，以维持tec的线粒体适应性。此外，用IL-10+EVs治疗将巨噬细胞极化为M2表型，以支持肾脏修复。

该研究为IL-10+EVs在缺血性AKI治疗中的临床应用提供了新的见解和方向。

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文末看点｜lumingbio

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